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人才强校 | 李孟华教授课题组通过新种质资源创制首次获得基因编辑短尾细毛羊

2022年08月15日 浏览次数:

中国农大新闻网讯 8月10日,《基因组研究》(Genome Research)在线发表中国农业大学动物科技学院李孟华教授课题组与新疆畜牧科学院生物技术研究所刘明军课题组题为《帕米尔盘羊、藏羊及其杂交后代的基因组分析为染色体进化、表型变异和种质创新提供了见解》(Genomic analyses of Pamir argali, Tibetan sheep, and their hybrids provide insights into chromosome evolution, phenotypic variation, and germplasm innovation)的研究论文。

该研究组装了高质量染色体水平的盘羊、西藏绵羊及其杂交F1代全基因组,揭示了非同源染色体间融合以及非整倍体杂交后代可育的遗传基础,探索了野生和家养绵羊的染色体进化机制。通过进一步构建野生帕米尔盘羊与西藏绵羊杂交群体以及哈萨克羊与特克塞尔羊杂交群体,利用盘羊与西藏绵羊杂交后代的新表型特征和高深度重测序数据,基于全基因组关联分析,发现了一批与重要表型性状(体重、体高、体斜长、胸围、臀围、管围、臀宽、臀高和尾长)相关的重要功能基因及突变,为绵羊种质创新提供了新的候选基因,尤其是发现的影响绵羊尾长和尾椎数的TBXT基因突变,为培育短尾绵羊提供了珍贵的基因资源。

图1 该研究实验设计框架及研究结果和目的

作为农业反刍动物典型代表,绵羊是最早被驯化的家养动物之一,为人类衣食保障发挥了不可替代的作用。我国绵羊现有存栏量达1.73亿只之多,约占全球13.5%,且呈逐年上升的趋势。我国地方绵羊品种丰富,然而其肉、毛、奶等主要生产性能均较低,优良的肉用及奶用种羊仍然需要进口,制约了我国绵羊产业的发展和种业振兴。野生绵羊与家养绵羊杂交后代可育,杂交羊与家养绵羊在生产性能和体型外貌上具有明显不同,揭示这些表型变化的遗传学基础,挖掘与重要性状相关的新基因,将为绵羊种质创新和新品种培育提供丰富的基因资源。

该研究构建了包含39个西藏绵羊、8个野生盘羊和328个杂交后代的大型杂交群体。通过组装高质量染色体水平的盘羊、西藏绵羊及其杂交F1代全基因组,研究发现从山羊到家羊发生了三次染色体融合事件,揭示非同源近端着丝粒染色体上同源DNA元件之间的序列特异性识别可能是其染色体融合的分子基础。具体的讲,盘羊的两对中间着丝粒染色体(LG01和LG02)分别源于山羊的1号和3号、5号和11号近端着丝粒染色体融合而来,这两对中间着丝粒染色体在家羊中被保留下来,对应其1号和3号染色体;山羊的2号和8号近端着丝粒染色体在盘羊中保留下来,对应盘羊中的LG04和LG07号染色体,这两条近端着丝粒染色体又进一步发生着丝粒融合,形成家羊绵羊中的第三对中间着丝粒染色体,即2号染色体。

图2 从山羊到绵羊属物种染色体进化关系

图3 家羊三条中间着丝粒染色体进化机制及F1代可育分子机制假设 (A) 家养绵羊的三条中间着丝粒染色体进化分子机制 (B) 野生盘羊与西藏绵羊杂交过程中染色体分离与配对示意图 (C) 非整倍体卵母细胞更倾向于产生27条染色体而不是28条染色体配子的分子假设机制

在生长性状方面,杂交羊通过引入野生盘羊血统,其表现显著高于西藏绵羊,通过对杂交羊和西藏绵羊的表型和生长性状(体重、体高、体斜长、胸围、管围、臀宽、臀高和尾长)进行了全基因组关联分析,鉴定了一系列候选基因:体重(PCDH10, HMGN1, TEK, FLRT2, IQCH, AUTS2和CASTOR2)、体高(MSRA, IQCH和UBASH3B)、体斜长(TEK, LINGO2, BMRP1B, PDLIM5和IQCH)、胸围(PCDH10和HMGN1)、管围(LGALSL, IQCH和TFB2M)、臀高(MRS2)、臀宽(ACTR3B和DPP6)和尾长(TBXT)。

为了进一步对尾长性状相关的TBXT基因进行验证,该研究再次构建110个特克塞尔羊(尾椎数较多的瘦尾羊)与哈萨克羊(尾椎数较少的肥臀羊)的F2代杂交羊群体,通过将103个肥臀绵羊与86个脂尾绵羊进行全基因组选择分析,以及GWAS分析,挖掘出位于TBXT基因内显著性最高的第333位同义突变位点c.333C>G和第334位非同义突变位点c.334C>A。

图4 尾长性状和体重性状的候选基因鉴定 (A) 尾长性状关联信号的曼哈顿和Q-Q分位数图 (B) TBXT基因周围区域连锁不平衡(LD)图 (C) 尾长性状信号最显著SNP位点在不同基因型个体的表型分布 (D) 体重性状关联信号的曼哈顿和Q-Q分位数图 (E) PCDH10和HMGN1基因周围区域连锁不平衡(LD)图 (F) 体重性状信号最显著SNP位点在不同基因型个体的表型分布。

图5 尾长性状的选择分析 (A) 肥臀羊和脂尾羊尾椎数CT扫描图 (B) 肥臀羊和脂尾羊尾椎数箱线图 (C) 肥臀羊与脂尾羊全基因组选择分析结果 (D) 位于8号染色体87.56–87.88 Mb区域肥臀羊和脂尾羊的选择分析结果

尾长的表型数据显示,在第334位非同义突变位点上未发生突变的纯合子基因型(CC)个体的尾长和尾椎数显著高于变异的杂合子基因型(CA)个体,而变异的纯合子基因型(AA)个体尾长和尾椎数最短。

图6 尾长性状GWAS分析及表型分布 (A) 基于F2代杂交个体的尾长和尾椎数性状关联信号的曼哈顿和Q-Q分位数图 (B) TBXT基因中第334位非同义突变位点c.334C>A不同基因型的表型箱线图 (C) CC基因型和AA基因型的尾型照片 (D) 靶向 TBXT 基因的第2个外显子sgRNA 序列和在CRISPR-Cas9 实验中用于同源重组介导修复的123-bp 单链 DNA 寡核苷酸 (ssODN)序列。

针对第334位非同义突变位点,基于CRISPR-Cas9基因敲除技术,对细毛羊进行TBXT基因编辑,在国际上首次获得了基因编辑短尾细毛羊,经过扩繁组建了基因编辑短尾细毛羊育种资源群,为培育短尾细毛羊创制了珍贵的种质资源。结果发现在19个美利奴羊突变体中,13个个体在该位点被修饰替换为AA,5个个体为纯合缺失,1个个体(GM079)既包含突变碱基A,也包含缺失。相比于野生型的尾长(~25.71 cm)和尾椎数(~18.47),GM079个体的尾椎数最少(11节)、尾长最短(10cm),碱基替换后的绵羊尾椎数(~15.07)和尾长(~20.82 cm)和位点敲除后的绵羊尾椎数(~15.17)和尾长(~19.33 cm)均显著少于野生型。另外,通过将GM079与野生型美利奴羊杂交,产生的19个含有突变碱基A的杂合个体和5个含有缺失的杂合个体的尾椎数均显著低于野生型。

图7 尾长性状基因编辑结果 (A) 野生型美利奴羊和基因编辑后的GM079个体的尾型照片 (B) 野生型美利奴羊、基因编辑后的GM079个体、以及GM079与野生型个体杂交后代的的尾型CT扫描照片 (C) 基因编辑后的美利奴与野生型美利奴羊的尾长和尾椎数箱线图 (D) GM079与野生型个体的杂交后代、野生型美利奴羊的尾长和尾椎数箱线图。

该研究对我们了解物种进化过程中基因组/染色体的形成,充分利用野生近缘种创制家畜新种质具有重要意义;研究发现的野生与家养绵羊杂交后代的新特征表型性状,为家畜育种提供了新的思路;创制的基因编辑短尾细毛羊种质资源和发现的新基因、新突变用于育种实践,为进一步加快绵羊遗传改良和新品种培育,打好种业翻身仗,推进种业振兴提供了新的种质资源和科技支撑。

中国农业大学动物科学技术学院李孟华教授和新疆畜牧科学院生物技术研究所刘明军研究员为论文共同通讯作者。中国农业大学与中国科学院动物研究所联合培养博士研究生李心,新疆畜牧科学院贺三刚研究员、李文蓉研究员为论文共同第一作者。新疆农垦科学院、甘肃省甘南藏族自治州畜牧科学研究所、中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所等单位的相关科研人员参与了本研究。该研究得到了国家重点研发计划,国家自然科学基金,第二次青藏高原综合科学考察研究,中国农业大学领军教授A类和国家级创新团队等项目的资助。

供稿:动物科学技术学院 李心 杨继

供图:动物科学技术学院 李心 杨继

编辑:欧阳永志

责编:武慧媛



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