近日，动物医学院陈耀星教授团队在《生物传感器和生物电子学》（Biosensors and Bioelectronics）上在线发表了题为《30分钟变构链置换可视化检测弓形虫》(Allosteric strand displacement isothermal amplification for the visual detection of Toxoplasma gondii in 30 minutes)的研究论文。论文以弓形虫为例，基于分子生物学原理，建立了一种简单、经济、快速的可视化比色检测方法，从采集样品到获取结果的完整检测过程仅需0.5小时。

在生物学研究中，为了达到研究目的，通常会对蛋白质、脂质、核酸、金属离子等物质进行检测，许多实验技术会呈现出特定的颜色变化，便于观察结果。例如，形态学中石蜡切片技术常用的HE染色法，可以将细胞核内的染色质与胞质内的核酸染至紫蓝色，使细胞质和细胞外基质中的成分染至红色。ELISA检测蛋白实验中，TMB被消化使溶液变为蓝色。这两类方法非常成熟，借助少量的设备即可达到结果可视化的目的，但是存在耗时较长的问题。近些年分子生物学发展迅速，新的可视化技术出现，例如使用金纳米颗粒检测DNA时，溶液会呈红色，但是这类方法成本较高，在大范围推广时会有限制。作为信号输出手段，可视化的结果优势很明显，即可以裸眼观察结果，因此它具有较大的发展潜力。考虑到当前很多可视化核酸检测方法存在改进的空间，论文试图对核酸靶标建立一种简单、快速、低成本的可视化检测方法。

论文以弓形虫为例，使用分子生物学方法对其基因组进行检测。常见的分子生物学方法多是基于qPCR和恒温扩增等技术，此类技术需要提取样品中微生物的基因组，目前商品化的提取试剂盒，至少需要半小时才能完成提取。为了解决上述问题，同时简化操作流程，论文对基因组提取、信号放大（扩增方法）和信号输出环节进行了改进。

对于基因组提取，论文评估了两种滤纸捕获基因组的能力，并设计了一种包含这两种滤纸的快速基因组提取装置，使基因组提取过程在10分钟内完成。其中上层滤纸的作用是过滤去除样本中的杂质，经过封闭处理后，捕获核酸的能力明显减弱，可以减少基因组的损失，使更多的基因组被下层滤纸捕获，提高检出率。

基因组提取装置

对于扩增方法，论文设计了一种新型恒温扩增（变构链置换，ASD）方法，可使扩增反应在20分钟内完成。已报道的恒温扩增方法一般需要两对引物才能在半小时内完成扩增，论文对引物进行了重新设计，通过在上下游引物5’端增加特定接头的方式，扩增产物可以持续延伸，并加速扩增反应。此扩增方式只需要一对引物，降低了引物设计难度，降低了恒温扩增技术的学习成本。

操作流程与反应原理

对于信号输出方法，论文采用商业化颜色指示剂溴百里酚蓝（BTB）进行信号输出。恒温扩增反应会产生大量的氢离子，从而引起反应溶液pH的变化。BTB在不同的pH条件下呈现不同的颜色，在碱性环境下显蓝色，在酸性条件下显黄色。与其他指示剂相比，BTB表现出更明显的颜色变化，在阳性样本中从蓝色变为黄色，便于视觉区分。对所有环节完成改进后，即建立了一种针对微生物核酸的快速可视化检测方法，从样本到结果的完整检测流程可在30分钟内完成。

BTB指示反应进程

中国农业大学动物医学院陈耀星教授团队的董玉兰教授与营养与健康系许文涛教授为文章共同通讯作者，2020级博士研究生王磊为第一作者。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116132