近日，中国农业大学动物科学技术学院袁建敏教授在国际权威期刊《生物资源技术》（Bioresource Technology）发表了题为“来源于泡盛曲霉的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的表达和特性及其与木聚糖酶降解玉米副产物”（Expression and characterization of α-L-arabinofuranosidase derived from Aspergillus awamori and its enzymatic degradation of corn byproducts with xylanase）的研究论文。

该研究通过将曲霉菌的序列密码子及表达载体进行优化后大大增强了阿拉伯呋喃糖苷酶酶活，利用毕赤酵母表达的阿拉伯呋喃糖苷酶可以协同木聚糖酶高效降解玉米副产物，对促进玉米减量替代及高效合理地利用低价值玉米副产品提供科学依据。

玉米是一种丰富的饲料，随着其生产和加工，会产生了一些低价值的副产品如玉米皮、膨化玉米皮玉米DDGS等。这些玉米副产物是一类具有挑战性的农业残留物，它们的阿拉伯木聚糖（AX）极其复杂，由一个β-1,4-链接的D-木质吡喃糖基骨架构成，其末端的α-L-阿拉伯呋喃糖基取代基连接在木糖基单元的O-2或O-3位置。与小麦相比，玉米皮拥有更多的乙酰基和AX侧链，可达0.6到0.7。因此，玉米副产物的完全降解需要在多种酶协同作用完成。α-L-阿拉伯呋喃糖是AX中相对丰富的取代物。阿拉伯糖取代物的分解可以减轻AX中的空间位阻，为木聚糖酶提供额外的结合点，并显著提高木聚糖酶的水解效率。同时，通过酶处理将农业残留物酶解成单糖和具有益生元活性的低聚木糖（XOS），已经成为生物质降解研究的一个趋势性课题。本实验室前期发现，基于麦麸AX的结构，采用特异性阿拉伯木聚糖酶组合(木聚糖酶+ α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶+阿魏酸酯酶) 降解不溶性阿拉伯木聚糖(WU-AX)和可溶性阿拉伯木聚糖(WE-AX)，可以更大程度的降解小麦阿拉伯木聚糖，产生益生元，促进肠道有益菌增值，从而改善畜禽肠道健康（文章发表在J Agri Food Chem, 2016,64:4932-4942；J. Agric. Food Chem. 2018；66:4725−4733；Front. Microbiol, 2021, 12:683905）。同时，利用此酶组合也可以有效降解玉米AX，并通过响应面优化玉米AX的酶解工艺并阐明其改善肉鸡生长性能效果机制（文章发表在Animals, 2022, 12, 2641； J Anim Sci Biotechno，2023，14:34）。

目前，市面上酶的产品种类众多，但阿拉伯木聚糖侧链酶很少见，构建高活性的侧链酶阿拉伯呋喃糖苷酶将有助于改善玉米阿拉伯木聚糖的利用。因此，本研究通过毕赤酵母高效表达阿拉伯呋喃糖苷酶，提高阿拉伯呋喃糖苷酶活性。通过体外试验验证阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶协同酶解玉米副产物的效果，对促进玉米减量替代及高效合理地利用低价值玉米副产品提供科学依据。

在这项研究中，来自泡盛曲霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（AF）在毕赤酵母X33中异源表达，经过序列密码子和表达载体的优化，AF活性提高了1倍，酶活可达29.04 U/mL，SDS‑PAGE分析在约95 kDa处得到条带。去糖基化处理后，分子量降低，且比活提高近2倍。经过发酵罐高密度发酵后，酶活可达6,683.9 U/g。蛋白纯化后，SDS-PAGE分析显示在95kDa处一条清晰的条带，比活可达14.47 U/mg。

AF的表达，发酵及蛋白纯化

半纤维素在结构和组成具有复杂性和异质性，需要一系列的糖苷水解酶进行有效的水解，要求酶具有较好的pH稳定性和热稳定性。AF的最适催化温度为50℃，最适pH为5.0。AF在60-65℃下保持稳定，并显示出在2.5-8.0广泛pH范围内具有较好的稳定性。同时，AF表现出较好的热稳定性，在60℃培养3小时后仍保持了近30%的活性，甚至在65℃培养3小时后也保持了近20%的活性。外源酶在动物体内发挥作用时会受到体内酶（胃、胰蛋白酶等）的影响，本研究进行了体外模拟，以评估饲料添加剂AF是否具有使其能够抵御动物消化道内消化酶水解的特性。研究发现，胃胰蛋白酶处理后，AF活性随着时间增加逐渐降低，但在80分钟胃蛋白酶处理后仍保留56.5%的酶活性，在80分钟胰蛋白酶处理后保留48.04%的酶活性。

GH51家族使用保留水解催化机制，会从植物多糖中释放非还原端α-L-阿拉伯糖残基。L-阿拉伯糖是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶催化过程中的一个抑制剂。本研究发现，AF对L-阿拉伯糖表现出很好的耐受性。在低浓度下（<200 mmol/L），L-阿拉伯糖对AF产生了促进作用。当浓度进一步增加时，L-阿拉伯糖对AF活性产生了抑制作用，例如在500mmol/L时，活性被抑制了15.14%。当D-木糖与AF一起孵育时，酶的活性受到轻微的抑制，甚至在某些浓度下反而增加（1,000 mmol/L）。这可能是由于糖和多元醇添加到酶水溶液中，增强了非极性氨基酸残基之间的疏水相互作用，导致蛋白质僵化和热活化。这项研究的结果为评估AF的饲用价值和推荐其作为外源酶的稳定剂提供了理论依据。

AF酶学性质分析

酶转化法是工业生产中从生物质中获得单糖和低聚木糖的最新方法之一，为开发和升级可再生生物质提供了可能性。然而，木聚糖的侧链取代基（如阿拉伯糖和乙酰基）会对木聚糖酶造成空间阻力，从而阻碍木聚糖酶发挥作用。因此，AX不能仅由木聚糖酶完全降解，需要AX支链降解酶的协同酶解。本研究发现，与单独的木聚糖酶相比，AF与木聚糖酶在降解膨化玉米皮、玉米麸皮和玉米DDGS表现出明显的协同效应，还原糖含量分别为单独木聚糖酶降解的3.6倍、1.4倍和6.5倍，协同效应程度分别提高到4.61、2.44和5.4，而体外干物质降解率分别为17.6%、5.2%和8.8%。离子色谱结果发现，玉米副产物酶解糖化后被转化为具有益生元活性的低聚木糖和阿拉伯糖。同时扫描电镜的结果更加直观展示了两种酶的协同效果，两酶处理后玉米副产物表面出现了明显的蜂窝状结构，证明了AF在降解玉米生物质及其副产品中的有利特性，对促进玉米减量替代及高效合理地利用低价值玉米副产品提供科学依据。

AF与木聚糖酶协同酶解玉米副产物

该研究由中国农大动物科技学院袁建敏教授和曹云鹤教授共同指导完成，动物科技学院2023级硕博连读生李春玥为论文第一作者。该工作受到“十四五”重点研发计划项目（2021YFD1301004）和伊品教授工作站的支持。